Scholar Hub/Chủ đề/#giải trình tự sanger/
Phương pháp Sanger, còn được gọi là phương pháp dideoxy, là một phương pháp được sử dụng để xác định trình tự nucleotide của một đoạn DNA hoặc RNA. Phương pháp ...
Phương pháp Sanger, còn được gọi là phương pháp dideoxy, là một phương pháp được sử dụng để xác định trình tự nucleotide của một đoạn DNA hoặc RNA. Phương pháp này được phát triển vào những năm 1970 bởi Frederick Sanger và đồng nghiệp của ông tại Trường Đại học Cambridge, Anh.
Phương pháp Sanger dựa trên quá trình tổ hợp mô phỏng của DNA và sự thêm vào cơ sở các nucleotide theo tỉ lệ thấp (dideoxynucleotide) khi phân tử polynucleotide được nhân đôi. Khi quá trình này diễn ra, dideoxynucleotide (được gắn nhãn với một chất xác định) sẽ làm ngừng sự sao chép vì không có nhóm hydroxyl dạng 3' để tiếp tục phản ứng. Số lượng các dideoxynucleotide thêm vào sau đó sẽ đều khác nhau cho mỗi một loại nucleotide. Kết quả là, chuỗi polynucleotide ban đầu sẽ được chia thành các đoạn có chiều dài khác nhau, từ đó cho phép xác định trình tự nucleotide.
Phương pháp Sanger đã trở thành phương pháp chuẩn để xác định trình tự DNA trong nghiên cứu và trong các ứng dụng y tế. Sự phát triển của phương pháp Sanger đã đóng góp quan trọng cho việc giải mã toàn bộ trình tự genôm con người.
Để giải thích chi tiết hơn về phương pháp Sanger, chúng ta có thể xem xét qua các bước chính của quy trình.
1. Chuẩn bị mẫu DNA hoặc RNA: Ban đầu, một mẫu chứa DNA hoặc RNA cần được chuẩn bị. Mẫu này thường là một đoạn nhỏ của DNA hoặc RNA, có thể là một fragment gen cụ thể hoặc cả một genôm.
2. Amplification: Mẫu DNA hoặc RNA được sao chép nhiều lần bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) hoặc các phương pháp tương tự. Quá trình này tạo ra một lượng lớn các đoạn DNA cần xác định trình tự.
3. Phản ứng chuỗi phá sản: Trong giai đoạn này, các dideoxynucleotide được sử dụng để tạo ra chuỗi DNA ngừng (terminating sequence). Điều này được thực hiện bằng cách pha trộn một lượng nhỏ dideoxynucleotide, gắn nhãn với một chất phát quang hoặc chuẩn xác, với các nucleotide thường.
4. Phân tích bởi phương pháp sắc ký: Các chuỗi DNA đã phản ứng chuỗi phá sản được phân tích bằng phương pháp sắc ký, thường là sắc ký polyacrylamide gel. Trong mỗi lần chạy gel, các mẫu DNA có độ dài khác nhau được tách ra thành các dải khác nhau dựa trên kích thước. Dideoxynucleotide sẽ dừng sự kéo dài của chuỗi tại các điểm tương ứng với nucleotide đó trong DNA mẫu.
5. Xác nhận trình tự: Kết quả của quá trình phân tích sắc ký (điện dòng) sẽ được ghi lại trong hình ảnh. Bằng cách so sánh các dải và kí hiệu trên gel với hàng chuỗi chuẩn đã biết trước, trình tự nucleotide của mẫu ban đầu có thể được xác định bằng cách đọc từ trái sang phải, mỗi đường dẫn trên chuỗi gel tương ứng với một nucleotide.
Phương pháp Sanger đã trở thành một công cụ quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng y tế, bao gồm việc xác định trình tự genôm, phát hiện các biến thể gen và phân tích quan hệ họ hàng. Các công nghệ mới hơn như việc sử dụng sequencing bằng điện tử (Next-Generation Sequencing) đã được phát triển để thay thế phương pháp Sanger và giúp xác định trình tự nhanh chóng và hiệu quả hơn.
Tạo và phát hiện các trình tự 16S rRNA chimeric trong các sản phẩm PCR được giải trình tự Sanger và 454-pyrosequenced Dịch bởi AI Genome Research - Tập 21 Số 3 - Trang 494-504 - 2011
Đa dạng vi khuẩn trong các mẫu môi trường thường được đánh giá bằng cách sử dụng các trình tự gen 16S rRNA (16S) khuếch đại bằng PCR. Tuy nhiên, sự đa dạng được cảm nhận có thể bị ảnh hưởng bởi việc chuẩn bị mẫu, việc lựa chọn mồi và hình thành các sản phẩm khuếch đại 16S chimeric. Chimera là các sản phẩm lai tạo giữa nhiều trình tự gốc có thể bị diễn giải sai là các sinh vật mới, do đó làm gia tăng sự đa dạng rõ ràng. Chúng tôi đã phát triển một công cụ phát hiện chimera mới gọi là Chimera Slayer (CS). CS phát hiện các chimera với độ nhạy lớn hơn so với các phương pháp trước đây, hoạt động tốt trên các trình tự ngắn như những trình tự được tạo ra bởi máy giải trình tự Genome của 454 Life Sciences (Roche), và có thể mở rộng đến các bộ dữ liệu lớn. Bằng cách so sánh hiệu suất CS với các trình tự từ một hỗn hợp DNA kiểm soát của các sinh vật đã biết và một tập hợp chimera được mô phỏng, chúng tôi cung cấp những hiểu biết về các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành chimera như sự phong phú của trình tự, mức độ tương đồng giữa các gen 16S và điều kiện PCR. Các chimera được phát hiện có xu hướng hình thành lại giữa các lần khuếch đại độc lập và góp phần vào những nhận thức sai lệch về sự đa dạng của mẫu cũng như việc nhận dạng sai các loại mới, với các loài ít phong phú cho thấy tỷ lệ chimera vượt quá 70%. Các trình tự metagenomic không mục tiêu của cộng đồng mô phỏng của chúng tôi dường như không có chimera 16S, hỗ trợ một vai trò của metagenomics trong việc xác nhận các sinh vật mới được phát hiện trong các khảo sát trình tự mục tiêu.
#chimera #16S rRNA #đa dạng vi khuẩn #phát hiện chimera #Chimera Slayer #metagenomic #khuếch đại PCR #trình tự gen #phân tử học #sinh vật mới
Giả-Sanger: sản xuất song song lớn các chuỗi dài và gần như không có lỗi sử dụng công nghệ NGS Dịch bởi AI Springer Science and Business Media LLC - - 2013
Tóm tắtBối cảnhCông nghệ giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) thường có đặc điểm là có thông lượng cực cao nhưng độ dài đoạn đọc lại rất ngắn so với phương pháp giải trình tự Sanger truyền thống. Giải trình tự NGS hai đầu có thể mở rộng độ dài đoạn đọc một cách tính toán nhưng mang theo nhiều bất tiện thực tiễn vì khoảng trống cố hữu. Hiện nay, giải trình tự hai đầu của Illumina có khả năng đọc cả hai đầu từ các đoạn DNA dài 600 bp hoặc thậm chí 800 bp, việc lấp đầy khoảng trống giữa hai đầu để tạo ra những đoạn đọc dài chính xác là vấn đề thú vị nhưng thách thức.
Kết quảChúng tôi đã phát triển một công nghệ mới, gọi là giải trình tự Giả-Sanger (PS). Công nghệ này cố gắng lấp đầy các khoảng trống giữa hai đầu và có thể tạo ra các chuỗi gần như không có lỗi tương đương với độ dài của các đoạn đọc Sanger truyền thống nhưng có thông lượng cao của giải trình tự thế hệ tiếp theo. Điểm mới cốt lõi của phương pháp PS nằm ở việc lấp đầy khoảng trống dựa trên việc lắp ráp cục bộ các đoạn đọc hai đầu có trùng lặp ở bất kỳ đầu nào. Do đó, chúng tôi có thể lấp đầy các khoảng trống trong vùng gen lặp lại một cách chính xác. Giải trình tự PS bắt đầu từ các đoạn đọc ngắn từ các nền tảng NGS, sử dụng một loạt các thư viện hai đầu có kích thước chèn giảm dần từng bước. Một phương pháp tính toán được giới thiệu để biến các đoạn hai đầu đặc biệt này thành những chuỗi PS dài và gần như không có lỗi, tương ứng với các đoạn có kích thước chèn lớn nhất. Việc xây dựng PS có 3 lợi thế so với các đoạn đọc không được biến đổi: lấp đầy khoảng trống, sửa lỗi và dung lượng dị hợp. Trong số nhiều ứng dụng của việc xây dựng PS là lắp ráp bộ gen de novo, đã được chúng tôi kiểm tra trong nghiên cứu này. Lắp ráp các đoạn đọc PS từ một dòng không đồng nhất của Drosophila melanogaster tạo ra một N50 contig dài 190 kb, cải thiện gấp 5 lần so với các phương pháp lắp ráp de novo hiện có và gấp 3 lần so với lắp ráp các đoạn đọc dài từ giải trình tự 454.
Kết luậnPhương pháp của chúng tôi tạo ra các đoạn đọc dài gần như không có lỗi từ giải trình tự hai đầu NGS. Chúng tôi đã chứng minh rằng lắp ráp de novo có thể có lợi rất nhiều từ các chuỗi giống Sanger này. Ngoài ra, đặc điểm của các chuỗi dài có thể được áp dụng vào các ứng dụng như phát hiện biến đổi cấu trúc và metagenomics.
#Giải trình tự giả-Sanger #công nghệ NGS #trình tự hai đầu #lỗi tự do #lắp ráp bộ gen de novo #Drosophila melanogaster
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH rs36211723 TRÊN GEN MÃ HÓA PROTEIN C LIÊN KẾT MYOSIN Ở NGƯỜI BỆNH CƠ TIM PHÌ ĐẠIĐặt vấn đề: Bệnh cơ tim phì đại (BCTPĐ) là bệnh di truyền phổ biến, do gen trội trên nhiễm sắc thể thường quy định. Đột biến trên các gen mã hóa protein đốt cơ (sacromere) của sợi cơ tim được cho là nguyên nhân di truyền chính gây ra BCTPĐ. Trong đó, đa hình rs36211723 thuộc gen mã hóa protein C liên kết myosin (MYBPC3) chiếm tỉ lệ lớn trong các đa hình gây bệnh cơ tim phì đại ở người Việt Nam. Vì vậy, việc tiến hành xây dựng quy trình phân tích đa hình di truyền rs36211723 ở người mắc BCTPĐ là thực sự cần thiết. Phương pháp: Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu tĩnh mạch, khuếch đại gen bằng PCR, xác định kiểu gen bằng giải trình tự Sanger. Kết quả và kết luận: Quy trình phân tích đa hình rs36211723 đã được hoàn thiện. Nghiên cứu được áp dụng thành công để phân tích kiểu gen của một gia đình bệnh nhân mắc BCTPĐ. Ngoài bệnh nhân, bố của bệnh nhân có mang đa hình này nhưng biểu hiện bệnh lý không rõ ràng, được bác sĩ khuyến cáo nên theo dõi tiến triển bệnh lý chặt chẽ để hạn chế biến chứng nặng xảy ra.
#rs36211723 #gen MYBPC3 #bệnh cơ tim phì đại #giải trình tự Sanger
PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DNA TY THỂ TRONG HỘI CHỨNG MELAS BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ SANGERMục tiêu: Hội chứng MELAS là một rối loạn di truyền ty thể có ảnh hưởng đến nhiều cơ quan và hệ thống của cơ thể, đặc biệt là hệ thần kinh và cơ. Bệnh do đột biến trong DNA ty thể, làm thay đổi protein trong chuỗi truyền điện tử thuộc ty thể. Nghiên cứu này nhằm ứng dụng các kỹ thuật di truyền để phát hiện đột biến DNA ty thể gây hội chứng MELAS. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: DNA của những bệnh nhân nghi ngờ mắc hội chứng MELAS được tách chiết từ mẫu máu ngoại vi. Kỹ thuật PCR-RFLP và giải trình tự Sanger được thực hiện để xác định các đột biến thường gặp. Kết quả: Thiết kế thành công các cặp mồi dùng cho nhân bản một số vùng trên DNA ty thể liên quan đến hội chứng MELAS. Hai đột biến điểm m.3243A>G và m.3697G>A được ghi nhận ở bệnh nhân mắc hội chứng MELAS, trong đó m.3243A>G có thể phát hiện bằng PCR-RFLP. Kết luận: Xây dựng thành công quy trình phát hiện đột biến DNA ty thể ở bệnh nhân mắc hội chứng MELAS bằng kỹ thuật PCR-RFLP và giải trình tự.
#Hội chứng MELAS #DNA ty thể #giải trình tự #PCR-RFLP
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ SANGER PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ DNA TY THỂMục tiêu: Ty thể đóng vai trò trung tâm trong quá trình chuyển hóa năng lượng của tế bào. DNA ty thể có tỷ lệ đột biến cao hơn so với DNA nhân và đột biến DNA ty thể là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây bệnh ở người. Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm phát hiện đột biến DNA ty thể ở người bằng kỹ thuật giải trình tự Sanger. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: DNA của những bệnh nhân nghi ngờ mắc các bệnh lý rối loạn ty thể được tách chiết từ mẫu máu ngoại vi. Sau đó, sử dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự bằng phương pháp Sanger để xác định các đột biến thường gặp. Kết quả: Nghiên cứu đã phát hiện 19 trường hợp có biến thể DNA ty thể trong tổng số 43 trường hợp thu thập được, trong đó đột biến m.3243A>G chiếm tỷ lệ cao nhất (73,68%). Kết luận: Xây dựng thành công quy trình phát hiện đột biến DNA ty thể ở bệnh nhân mắc các bệnh lý rối loạn ty thể bằng kỹ thuật giải trình tự.
#Bệnh lý ty thể #DNA ty thể #giải trình tự Sanger
QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ SANGER MỘT SỐ BIẾN THỂ ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE TRÊN CÁC GEN PNPLA3, TM6SF2, MBOAT7 VÀ GCKR LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH GAN NHIỄM MỠ KHÔNG DO RƯỢUMục tiêu: Xây dựng quy trình giải trình tự Sanger khảo sát năm biến thể trên các gen PNPLA3, TM6SF2, MBOAT7 và GCKR liên quan đến bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD). Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tối ưu hóa quy trình ly trích DNA có ly giải hồng cầu bằng dung dịch ACK, thiết kế 5 cặp đoạn mồi đặc hiệu cho các biến thể, tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của phản ứng PCR và tối ưu hóa phản ứng giải trình tự Sanger trên hệ thống Applied Biosystems 3500 (ThermoFishser). Áp dụng toàn bộ quy trình giải trình tự Sanger đã tối ưu lên 4 mẫu máu của người tình nguyện nhằm đánh giá thông số kỹ thuật và đặc điểm của các biến thể. Kết quả: Xây dựng thành công quy trình giải trình tự Sanger bao gồm: tối ưu hóa được lượng thể tích (4 ml) và thời gian ly giải hồng cầu với ACK (10 phút) để thu được DNA có độ tinh khiết đạt chuẩn, thiết kế được năm cặp đoạn mồi khuếch đại đặt hiệu năm biến thể quan tâm. Khảo sát DNA 4 người tình nguyện khỏe mạnh, tất cả đều có ít nhất một trong năm biến thể quan tâm, với tất cả kết quả giải trình tự có tỉ lệ nucleotide có độ chính xác cao-QVB > 90%. Kết luận: Đã xây dựng và tối ưu quy trình giải trình tự Sanger xác định biến thể đa hình đơn nucleotide. Bước đầu áp dụng quy trình trên người tình nguyện, làm cơ sở cho các khảo sát với cỡ mẫu đại diện giúp tiếp cận và quản lý ở phương diện phân tử NAFLD ở Việt Nam.
#Giải trình tự Sanger #bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu #PNPLA3 #TM6SF2 #MBOAT7 và GCKR
1. Xác định người lành mang biến thể gen gây bệnh β-thalassemia bằng kỹ thuật giải trình tự gen sanger và kỹ thuật MLPABệnh Thalassemia là bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới. Ước tính tỷ lệ mang gen thalassemia trung bình trong cộng đồng tất cả các dân tộc Việt Nam là 13,8%. β-thalassemia thể nặng có biểu hiện thiếu máu tan máu nặng, ảnh hưởng đến khả năng sống, chất lượng sống của người bệnh. Việc sàng lọc, chẩn đoán sớm người bệnh, người mang gen trong cộng đồng đóng vai trò quan trọng giúp hạn chế sinh ra trẻ mắc bệnh β-thalassemia. Nhiều kỹ thuật phân tử đã được phát triển nhằm phát hiện đột biến gây bệnh β-thalassemia trong đó giải trình tự DNA là tiêu chuẩn vàng để xác định các đột biến điểm và MLPA dùng để xác định đột biến mất đoạn/lặp đoạn. Với mục tiêu phát hiện các biến thể gen HBB gây bệnh β-thalassemia ở người lành mang gen bằng kỹ thuật giải trình tự gen Sanger và kỹ thuật MLPA, nghiên cứu tiến hành trên 102 trường hợp thiếu máu hồng cầu nhỏ nhược sắc, điện di huyết sắc tố nghi ngờ mang biến thể gây bệnh trên gen β-globin đã loại trừ thiếu máu thiếu sắt. Kết quả đã xác định được 102 trường hợp đều mang đột biến gây bệnh trên gen HBB, trong đó 97% là đột biến điểm và 3% là đột biến mất đoạn, các loại đột biến thường gặp có CD26 chiếm 39,2%, CD17 chiếm 22,5%, CD41/42 chiếm 21,6%.
#β-thalassemia #Sanger #giải trình tự #MLPA #người mang gen bệnh
PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN BỆNH -THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN SANGERb-thalassemia là một bệnh rối loạn di truyền lặn do đột biến gen HBB nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 11 gây suy giảm tổng hợp chuỗi b-globin. Mỗi năm có khoảng 60.000 – 70.000 trẻ em sinh ra bị bệnh b-thalassemia trên toàn thế giới trong đó có Việt Nam. Trên 350 đột biến gây bệnh b-thalassemia đã được công bố. Phát hiện người lành mang đột biến gen HBB gây bệnh b-thalassemia có vai trò quan trọng trong tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán tiền làm tổ nhằm giảm tỉ lệ trẻ sinh ra bị bệnh. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu “xác định các đột biến trên gen HBB ở những người có nguy cơ cao mang đột biến gen gây bệnh b-thalassemia bằng kỹ thuật giải trình tự gen Sanger”. Kết quả: xác định 10 đột biến gây bệnh bao gồm: CD26(HbE), CD17, CD41/42, CD95, CD35, CD71/72, IVS-I-1, -28, -88, IVS-II-654. Trong đó CD26(HbE) chiếm tỉ lệ cao nhất 38%; tiếp theo là CD17, CD41/42, -28, CD95 chiếm tỉ lệ lần lượt là 22%, 20%, 8%, 4%, các đột biến còn lại chiếm dưới 4%.
#-thalassemia #-globin #giải trình tự Sanger #đột biến gen HBB
Phân lập và lưu trữ vi khuẩn Fusobacterium nucleatum từ mảng bám dưới nướu của bệnh nhân viêm nha chuMục tiêu: Phân lập và lưu trữ chủng vi khuẩn Fusobacterium nucleatum (Fn) từ mảng bám dưới nướu của bệnh nhân viêm nha chu. Phương pháp: Mẫu thu thập được từ mẫu mảng bám dưới nướu của bệnh nhân viêm nha chu giai đoạn III và IV có độ tuổi 18 - 65, vận chuyển và nuôi cấy trong môi trường chọn lọc, ủ 37oC trong điều kiện kỵ khí trong tối thiểu 3 ngày. Sau khi xác định gram, hình dáng và màu sắc đặc trưng, mẫu khuẩn lạc được gửi định danh bằng phương pháp giải trình tự Sanger. Thu thập mẫu cho tới khi nuôi cấy thành công vi khuẩn và lưu trữ ở nhiệt độ -80oC. Kết quả: Vi khuẩn Fn nuôi cấy thành công và kết quả giải trình tự khẳng định chủng vi khuẩn phân lập. Kết luận: Fn là vi khuẩn có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học nha chu. Nuôi cấy và lưu trữ thành công vi khuẩn Fn từ mảng bám dưới nướu của bệnh nhân viêm nha chu tạo nguồn vi khuẩn sẵn có, phục vụ cho các thí nghiệm nghiên cứu đa dạng trong y sinh học và nha khoa.
#vi khuẩn Fusobacterium nucleatum (Fn) #mảng bám dưới nướu #giải trình tự Sanger
4. Xác định người lành mang biến thể gen α- thalassemia bằng kỹ thuật giải trình tự genKhoảng 5% bệnh α-thalassemia gây nên do đột biến điểm. Biến thể trên gen HBA1 và HBA2 làm thiếu hụt chuỗi α-globin cấu thành nên phân tử Hemoglobin. Tùy theo số lượng chuỗi α bị thiếu hụt mà mức độ biểu hiện lâm sàng của bệnh ở các cấp độ khác nhau. Bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường nên việc xác định người lành mang gen bệnh có ý nghĩa quan trọng trong tư vấn di truyền nhằm giảm tỉ lệ sinh con mắc bệnh trong cộng đồng. Bằng kỹ thuật giải trình tự gen, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên mẫu máu của 9 trường hợp nghi ngờ mang gen α-thalassemia nhưng không phát hiện mất đoạn gen nhằm xác định được người lành mang biến thể gây bệnh trên gen HBA1 và HBA2. Nghiên cứu đã xác định được 4 dạng biến thể trên gen HBA2 ở 9 người mang gen dị hợp trong đó 5/9 người mang biến thể -αHbCs, 2/9 người mang biến thể -αHbQs, 1 trường hợp mang biến thể c.2delT và 1 trường hợp mang biến thể mới c.-2C>T chưa được báo cáo trên các cơ sở dữ liệu.
#người lành mang gen bệnh α-thalassemia #giải trình tự Sanger #đột biến điểm
