Giải trình tự sanger là gì? Các công bố khoa học về Giải trình tự sanger

Giải trình tự Sanger là gì?

Giải trình tự Sanger, hay còn gọi là phương pháp chấm dứt chuỗi (chain termination method), là một kỹ thuật sinh học phân tử được Frederick Sanger phát triển vào cuối thập niên 1970. Đây là một trong những phương pháp đầu tiên cho phép các nhà khoa học xác định chính xác trình tự nucleotide trong một đoạn DNA. Phương pháp này nhanh chóng trở thành tiêu chuẩn vàng trong ngành di truyền học suốt hơn ba thập kỷ và là nền tảng cho Dự án Giải mã Bộ gen Người (Human Genome Project).

Mặc dù hiện nay đã có nhiều phương pháp giải trình tự hiện đại hơn với tốc độ và năng suất cao hơn, giải trình tự Sanger vẫn được sử dụng rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nhờ độ chính xác cao, đơn giản về mặt kỹ thuật và dễ triển khai cho các đoạn DNA ngắn.

Nguyên lý của giải trình tự Sanger

Giải trình tự Sanger dựa trên quá trình tổng hợp chuỗi DNA mới từ một sợi khuôn (template) bằng enzyme DNA polymerase. Trong quá trình này, ngoài các nucleotide bình thường (dNTP), người ta bổ sung thêm một tỷ lệ nhỏ các nucleotide biến đổi gọi là dideoxynucleotide (ddNTP). Các ddNTP khác với dNTP ở chỗ chúng không có nhóm hydroxyl (-OH) tại vị trí 3’ của đường deoxyribose, khiến cho khi một ddNTP được gắn vào chuỗi đang tổng hợp, quá trình kéo dài chuỗi sẽ bị dừng lại tại điểm đó.

Ví dụ, nếu ddATP được chèn vào thay vì dATP, phản ứng sẽ chấm dứt tại một base A. Khi mỗi loại ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP) được đánh dấu bằng các màu huỳnh quang khác nhau, người ta có thể xác định được base tương ứng với mỗi điểm kết thúc.

Các thành phần cần thiết trong phản ứng

• DNA khuôn: đoạn DNA cần giải trình tự
• Primer: một đoạn oligonucleotide ngắn dùng để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA
• DNA polymerase: enzyme xúc tác phản ứng tổng hợp DNA
• dNTPs: 4 loại nucleotide tự nhiên (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
• ddNTPs: 4 loại nucleotide chấm dứt chuỗi, được gắn nhãn huỳnh quang hoặc phóng xạ

Nguyên lý phản ứng tổng hợp DNA

Quá trình tổng hợp DNA diễn ra tương tự như phản ứng PCR nhưng chỉ sử dụng một primer. Khi một ddNTP được chèn vào chuỗi, quá trình tổng hợp bị chấm dứt và tạo thành các đoạn DNA có chiều dài khác nhau, mỗi đoạn kết thúc tại vị trí chứa một loại base cụ thể.

Phản ứng tổng quát như sau:

$(DNA)_{n} + dNTP \xrightarrow{DNA\ polymerase} (DNA)_{n+1} + PP_i$

Nếu ddNTP thay thế dNTP:

$(DNA)_{n} + ddNTP \rightarrow (DNA)_{n+1} \text{ (kết thúc chuỗi)}$

Phân tích kết quả giải trình tự

Sau khi phản ứng hoàn tất, hỗn hợp các đoạn DNA có chiều dài khác nhau được phân tách bằng điện di mao quản (capillary electrophoresis). Trong quá trình di chuyển qua mao quản, máy giải trình tự sẽ ghi nhận tín hiệu phát ra từ các nhãn huỳnh quang tương ứng với mỗi loại ddNTP, từ đó tái tạo trình tự DNA.

Trình tự đọc được

Các tín hiệu phát sáng được sắp xếp theo thứ tự di chuyển, nghĩa là từ đoạn DNA ngắn nhất (gần primer) đến dài hơn, phản ánh đúng thứ tự các nucleotide của DNA ban đầu.

Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp Sanger

Ưu điểm

• Độ chính xác rất cao, tới 99.99% trong các điều kiện tối ưu
• Rất hiệu quả cho các đoạn DNA ngắn dưới 1000 base
• Được chấp nhận rộng rãi trong cộng đồng khoa học
• Là công cụ xác thực chuẩn mực cho các kết quả từ phương pháp NGS

Nhược điểm

• Không phù hợp cho giải trình tự hệ gen lớn hoặc các nghiên cứu đòi hỏi throughput cao
• Chi phí giải trình tự cao khi xét trên mỗi base
• Cần nhiều thời gian và thao tác thủ công hơn so với công nghệ mới

Ứng dụng thực tế

• Phân tích đột biến gen gây bệnh di truyền, ví dụ như BRCA1, CFTR
• Xác minh trình tự plasmid trong sản xuất protein tái tổ hợp
• Giải mã các đoạn DNA mục tiêu trong xét nghiệm y học
• Kiểm tra và xác thực kết quả từ công nghệ giải trình tự thế hệ mới
• Sử dụng trong pháp y và kiểm tra huyết thống

So sánh giữa Sanger và công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS)

Mặc dù NGS đang là xu hướng chính trong nghiên cứu hệ gen, giải trình tự Sanger vẫn giữ vai trò quan trọng trong nhiều ứng dụng. Dưới đây là bảng so sánh giữa hai công nghệ:

Ví dụ minh họa

Giả sử chúng ta muốn xác định trình tự của đoạn DNA sau:

3’ – TACGATCG – 5’

Với primer bám vào đầu 3’, phản ứng giải trình tự sẽ tạo ra các đoạn DNA kết thúc tại từng base khác nhau. Sau điện di mao quản, tín hiệu đèn huỳnh quang ghi lại lần lượt sẽ cho chúng ta thứ tự base như sau:

5’ – ATCGTACG – 3’

Hạn chế về mặt kỹ thuật và cải tiến

Dù chính xác, phương pháp Sanger vẫn tồn tại một số hạn chế. Một trong số đó là khó khăn trong việc đọc qua các đoạn DNA có cấu trúc thứ cấp mạnh hoặc vùng giàu GC. Các cải tiến hiện nay như sử dụng enzyme polymerase cải biến, tối ưu hoá nồng độ muối và primer đã giúp cải thiện hiệu suất của kỹ thuật này.

Các nhà cung cấp và thiết bị phổ biến

• Thermo Fisher Scientific: cung cấp hệ thống giải trình tự Applied Biosystems 3500, 3730
• Beckman Coulter: cung cấp thiết bị xử lý mẫu tự động
• Promega: cung cấp bộ kit tinh sạch DNA trước giải trình tự

Tham khảo thêm

• NCBI – Sanger sequencing: still the gold standard
• NHGRI – Sanger Sequencing Overview
• Thermo Fisher – Sanger Sequencing Technology